近年来生物发酵相关工程技术的应用领域日益广泛，在农业生产方面，利用有益微生物进行发酵，收集菌体或相关代谢产物用于增产、防病等方面的研究逐渐增多。其中获得关多、研究范围广的主要集中在如何优化发酵工艺，增加不同微生物的发酵相关产物。众所周知，不同的微生物由于自身菌种特性，需要不同的发酵条件才有助于其有益发酵产物的生成，因此目前国内外对发酵工艺的优化研究，主要围绕培养基不同成分如碳源、氮源、微量元素等的选择，以及发酵条件包括发酵温度、pH值，溶氧量等的优化。通过采用不同的工艺优化方法，有效提高发酵过程的生产效率，同时降低生产成本，促进发酵工程技术的快速发展。
1培养基对发酵的影响
发酵培养基主要用来满足微生物在大量生长繁殖或代谢产物合成时的营养物质及能量需求，其组成成分对菌体生长繁殖能力、产物的生物合成效率乃至产品的产量和质量都有重要影响。在微生物产品发酵的科研和生产工作中，由于菌种不同、生长阶段不同以及发酵工艺条件的差异，所使用的培养基也不尽相同。培养基的原材料归纳起来有碳源、氮源、无机盐和微量元素等。
1.1发酵培养基碳、氮源的选择
培养基中碳源的主要作用是供给微生物进行生命活动所需要的能量，同时构成微生物细胞成分和代谢产物中的碳源来源。一般微生物对碳素化合物的需求是极其广泛的，对于多数微生物来说，己糖是重要的碳源和能源。考虑到成本及材料易得性，目前发酵工程中常用的碳源主要有淀粉（如山芋粉、玉米粉、木薯粉、大米等）、蔗糖（甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等）、麸皮、米糠、纤维素等。
微生物发酵培养中氮源的主要作用是作为微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源（可以直接被菌体吸收利用）被称为速效氮源；必须通过水解后降解形成胨、肽、氨基酸等才可以被机体利用的蛋白被称为迟效氮源。速效氮源通常有利于菌体的生长，而迟效氮源有利于代谢产物的形成。实验室和生产上常用做氮源的材料有(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏以及蛋白质含量较高的黄豆粉、鱼粉、花生饼粉、豆粕等。为了满足菌体发酵、产物合成对氮源的需求，有学者在发酵培养基中采用酵母浸膏、蛋白胨及(NH4)2SO4配比，速效氮源与长效氮源搭配的复合氮源，既满足了节杆菌属（Arthrobacter）细菌YB6的生长，又促进了其抑制青枯病原菌拮抗物质的生成，取得了较好的发酵效果。
1.2发酵培养基中无机盐对发酵的影响
无机盐如磷、硫、钠、钾、镁、铁、锌、锰等元素对发酵过程中微生物的生长及代谢产物生成都具有一定的影响。研究发现，许多金属离子在低浓度条件下有益于微生物的生理活动，而当浓度过高时主要表现为抑制等负面效应。
磷是微生物生长代谢活动中的重要元素，既参与了磷脂、核酸以及多种辅酶的构成，同时还在代谢调节方面发挥着重要作用。苏云金芽孢杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中含有磷酸根，因此其发酵培养基中磷酸盐的需求较其他微生物多，常亚飞等在其苏云金芽孢杆菌发酵培养基中添加的KH2PO4达3.1g/L，Huang等为了增加苏云金素的产量，在发酵培养基中加入的KH2PO4和K2HPO4总和高达10g/L。
Ca2+主要参与调节细胞的生理状态，如降低细胞膜的通透性、维持细胞的胶体状态等。已有研究表明CaCO3是多数芽孢杆菌发酵培养基中不可缺少的一种成分，对发酵液含菌量的变化有显著影响效应。张丽霞等对枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）B908进行发酵培养基的优化，发现CaCO3对发酵后菌量有较大的影响，推测其主要作用可能是促进芽孢的形成和调节培养基pH值。
Mn2+是芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌生长，特别是芽孢生成的必需元素，适当提高Mn2+浓度将会在一定程度上导致培养基在成分上出现比例失调、渗透压升高等一系列变化，形成不良的繁殖环境，从而诱导芽孢生成。孙梅等通过对发酵培养基成分的筛选发现Mn2+浓度为2.4mmol/L时对纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）芽孢的形成率和活菌数均有利。候美玲等发现，在发酵培养基中添加MnCl2可以有效提高枯草芽孢杆菌发酵产物抑菌物质活性，提高其对玉米大斑病的防治效果。
总之，发酵培养基成分应该尽可能地具备以下特点：（1）满足特定微生物生长和产物形成的营养需要；（2）有适当的物理性状；（3）主要原料的价格便宜，来源充足，质量稳定。
2培养条件对发酵的影响
微生物只有在适宜的环境条件下才能正常生长繁殖。在发酵生产中，除培养基成分及其浓度外，只有环境条件能够被直接调控，发酵过程中的温度、pH值、溶解氧等环境变量都能够对微生物的繁殖、代谢活动造成影响。通过调整控制培养条件，为微生物创造适宜的环境，是提高发酵产物产量、质量的重要手段。
2.1初始pH值对发酵的影响
pH值是确保微生物正常繁殖、代谢的重要参数，初始pH值对不同种类微生物发酵后目的产物的产量及质量影响较大，其主要原因在于：（1）pH值影响微生物细胞原生质膜的电荷，进而影响微生物的生长和新陈代谢的正常进行；（2）pH值直接影响微生物细胞内的酶活性，从而影响微生物的生长繁殖和新陈代谢；（3）pH值影响培养基中某些重要的营养物质和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的吸收和利用。常亚飞等在对苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的研究中发现其芽孢萌发率在pH7.0时高，当pH值过小（小于6.5）或过大（大于8.0）时，萌发率显著降低，仅为40%；此外，如果培养基pH值不合适，还会对毒素产量造成影响，甚至完全不产生伴胞晶体毒素。黄明媛在对生防菌株YB6的研究中发现，在初始pH9.0的碱性环境下，菌株发酵产物对番茄青枯病原菌的抑菌活性强。
2.2接种量及种龄对发酵的影响
种龄即接入的种子液中目标微生物所处的生长时期，一般来说，种子液的种龄以多数微生物菌体处于生命力旺盛的对数生长中后期为宜。将种龄适宜的优质种子液以合适的接种量接入发酵培养基后，可以使目标微生物快速进入对数生长期，缩短发酵周期，提高产物质量。若种龄过短或过长，就会造成发酵周期延长，菌体活力降低，甚至引起菌体过早衰老、自溶。若接种量过大，培养基消耗加快，菌体快速进入稳定和衰亡期，对于收获发酵产物如苏云金素、青霉素等发酵过程的影响较大；若接种量过小，造成菌体细胞生长量小，延滞到达对数生长期的时间、延长发酵时间，对于一些酶产物的生成也会造成不利影响。国内学者朱秀清等通过试验发现，以4%的接种量向豆粕中接入高温豆粕菌种进行发酵时，豆粕的水解度高。
2.3温度对发酵的影响
温度对发酵的影响主要表现在直接效应和间接效应两个方面。直接效应包括影响微生物的生长速率、酶活性、细胞组成和营养需求等；间接效应包括影响溶质分子的溶解性、离子的运输和扩散、细胞膜的渗透压及表面张力等。高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝固，同时还破坏了微生物细胞内的酶活性，从而杀死微生物；而低温又会抑制微生物的生长。研究表明，用于植物病害防治的普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)在一定温度范围内，生长速率随温度的升高而加快，同时大菌液浓度也随温度升高而增大，但温度过高会抑制沙雷氏菌的生长，*终在优化过程中以28℃为适发酵温度。在另外一些微生物的培养过程中，各个发酵阶段的适温度也不同，例如在青霉素的发酵过程中，如果按照*初5h30℃、6~35h25℃、36~85h20℃，*后40h再升到25℃的方式来控制各阶段的发酵温度，可使发酵后青霉素产量比25℃恒温培养提高10.7%。
2.4溶氧对发酵的影响
溶氧是发酵中的另一重要因素，好氧的液体发酵中通常需要供给大量的空气才能满足微生物对溶氧的需求。溶氧不仅影响次生代谢产物的合成途径，也会影响代谢的合成速度。在发酵过程中，由于菌体密度高，发酵过程摄氧量大，摇瓶条件下一般采用降低装液量、增加转速，发酵罐条件下一般采用增大搅拌转速和增加空气流量来达到增加溶氧量的目的。叶云峰等指出装液量对枯草芽孢杆菌B47产抗菌物质影响，且具有负效应，即装液量越少，菌株产生的抗菌物质越多。Mohamed等对球形芽孢杆菌(Bacillussphaerlcus)芽孢形成与溶解氧的关系进行研究，发现溶解氧浓度在一定范围内与芽孢形成量呈正相关，溶解氧浓度过高时，反而会造成产孢量下降。推测其原因可能是在对数生长期和芽孢形成期，充足的通气量使得发酵培养基中的溶氧水平升高，从而有利于芽孢的产生；但通气量过大导致出现溶解氧过量时，菌体自溶现象的出现反而使芽孢数下降。
3微生物发酵工艺优化方法
在对微生物发酵工艺的优化研究中，如何有效开展发酵培养基的成分、培养条件的单独或组合式优化试验，从而高效、系统地获得微生物目标产物，已成为国内外众多学者的研究热点。优化方法也由*初简单的单次单因子法（One-variable-at-a-time），发展到统计学相关方法如正交试验（Orthogonalexperiment）设计、均匀设计（Well-distributeddesign）等，随着计算机的广泛普及和统计软件的发展，越来越多的研究者应用统计软件对试验结果进行数学模拟和优化，国外学者多是依据Plackett-Burman试验设计方案来筛选优化因子，然后在中心组合实验设计基础上采用响应面分析法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)以达到优化目的。下面具体介绍几种目前使用较多的优化方法。
3.1正交试验设计法
正交试验设计法，是用“正交表”来安排和分析多因素问题的一种数理统计方法，得出结果后可以通过直接比对及直观分析来找到影响指标的主要因素，在应用过程中具有试验次数少、效果好、方法简单、使用方便、效率高等优点。因此，正交试验法在工农业生产和其他科学研究领域中得到广泛应用，并取得显著的效果。郝林华等采用单因素试验与正交试验相结合的方法，对枯草芽孢杆菌的液体发酵培养基进行优化，大大提高了发酵后菌体产量。Nikhil等使用正交试验的方法对短密青霉(Peni-cilliumbrevicompactum)生产康帕丁的固态发酵培养基进行优化，优化后康帕丁产量增加了80%以上。王云霞和荆卓琼使用正交试验分别对产酶溶杆菌(Lysobacteren-zymogenes)OH11和枯草芽孢杆菌B2的发酵工艺进行优化，并得到预期的试验结果。
3.2Plackett-Burman设计法
Plackett-Burman设计法是一种针对因子数较多的两水平的试验设计方法，可快速有效地从所考察的众多因素中将对试验结果影响具有显著性的几个重要因素筛选出来。一般在使用Plackett-Burman设计法开展试验时，开展的N次试验至多可研究(N-1)个因素，对每个因素取两个水平，其中一般设低水平为原始培养条件，高水平为低水平的1.25倍，通过比较各个因素两水平的差异与整体的差异来确定因素的显著性，避免在后期的优化试验中由于因素数太多或部分因素不显著而浪费试验资源。将得到的重要因素进一步通过开展响应面设计等方法筛选得到工艺。Walid结合运用Plackett-Burman设计与响应面设计法，通过一系列发酵工艺优化，显著提高了支顶孢属（Acremoniumchrysogenum）发酵后的头孢霉素C（CephalosporinC）产量。袁辉林等利用Plackett-Burman设计方法从乳杆菌发酵生产乳酸的初始培养基中碳源、氮源、诱导物等35个培养基组分里筛选对乳酸产量影响较大的重要因素，并利用优化后的培养基进行发酵，取得了预期的结果。
3.3响应面设计法
响应面设计法（ResponseSurfaceMethodology,RSM）结合了数学建模、试验设计、统计分析技术，通过合理的试验设计得到的数据，采用多元二次回归方程对因素与试验结果（响应值）之间的函数关系进行拟合，建立回归方程，并绘制图形，在图形中判别优化区域，寻求的工艺参数，从而解决多变量因素对试验影响的一种统计方法，具有直观、可信度高等特点。RSM中为常用的方法是Box-Behnken设计（Box-BehnkenDesign，BBD）和中心组合设计（CentralCompositeDesign，CCD）。运用RSM开展工艺优化的一般步骤为：试验设计、建立数学模型评估相关性、预测响应值并通过实际试验考察模型准确性。
近年来，由于统计及建模在各个领域中的广泛发展和应用，响应面设计法的应用领域进一步拓宽，对其感兴趣的学者也越来越多，应用范围遍布生物学、医学、生物制药领域以及食品学、工程学、生态学等诸多领域。在微生物研究领域，响应面法的应用相当广泛。Banga等在进行黄曲霉(AspergillusFlavus)发酵产肝素酶试验时，通过RSM法优化了黄曲霉的培养基成分，将发酵后肝素酶的产量提高了2.37倍。王飞等应用RSM法对北虫草液体发酵培养基组分进行优化，采用3因素3水平BBD设计得到的发酵培养基组成，运用多元二次回归方程拟合3种因素与发酵后多糖产量之间的函数关系，通过分析并验证，获得培养基中3个因素的配方为：蔗糖3.23%，蛋白胨1.05%，KH2PO40.08%。运用响应面法对具有生防效果的枯草芽孢杆菌进行发酵工艺优化，均得到了目标产物产量较高的优化工艺。
4结语
随着生物技术的迅速发展，对微生物研究的逐渐深入，微生物发酵工程的开展日益广泛，在熟悉微生物特性的基础上，合理运用优化方法对其发酵工艺进行优化改进，将有助于提高生产效率，推动发酵工程技术的不断进步，从而促进有益微生物在医药、卫生、农业、工业等多个领域的产业化发展应用。
录入时间：2020/12/12 17:21:59 点击次数:1764